РАЗРУШЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПЕРГИДРОЛЕМ
А. К. Семячков
Тюмень
Пероксид (перекись) водорода Н202 (ПВ) является сильнейшим реагентом, способным окислить практически все вещества за исключением немногих более сильных, чем он, окислителей, например, озона, фтора. Исследователи, тем не менее, предпочитают разрушать органические вещества (ОВ) другими реактивами — концентрированными кислотами, щелочами и др. А если и используют ПВ, то в смеси с этими реактивами или после предварительной обработки ими ОВ. Окисление одним ПВ применяют редко. В. Ф. Крамаренко (1989) указывает вслед за Р. Боком (1984), что при взаимодействии ПВ с некоторыми ОВ может произойти взрыв. Поэтому сначала необходимо частично окислить ОВ концентрированной серной кислотой или смесью концентрированных серной и азотной кислот, а затем добавлять ПВ.
Мы полагаем, что значение взрывчатых свойств ПВ и его соединений в данном случае преувеличено. Параметры, при которых эти свойства могут проявиться, настолько хорошо известны, что в справочниках по технике безопасности не упоминается о взрывоопасности ПВ.
В растворах взрыв может быть инициирован сильным ударом или открытым пламенем при концентрации ПВ более 80% и наличии некоторых органических веществ или катализаторов.
По нашим наблюдениям, некоторые процессы, происходящие в растворе ПВ при разрушении трупного материала, могут произвести впечатление микровзрывов. Дело в том, что ПВ действует не только на поверхности кусочков биоматериала, но проникает и внутрь. Окисляя ОВ, ПВ разлагается на кислород и воду. Образующийся кислород, накапливаясь внутри кусочков, разрывает их с легким треском. При этом кусочки перемещаются в какую-либо сторону или разрываются на части. В парах взрыв может произойти, если они содержат 26 и более молярных % ПВ и контактируют с катализатором, нагретым некаталитическим материалом (например, алюминий при 150°С и выше) или искрой. Пары с такой концентрацией ПВ могут возникнуть только при кипячении 70% и более концентрированных растворов ПВ. Таким образом, главным условием для возникновения взрыва является высокая концентрация ПВ, которой нельзя достигнуть при кипячении пергидроля в открытой колбе со свободным выделением паров. Для концентрирования растворов ПВ и его паров необходимы специальные условия и оснащение. Наш личный опыт разрушения органов и тканей пергидролем, проводимого с обычными предосторожностями, убеждает в безопасности работы с ним.
По нашему мнению, серьезным препятствием для окисления трупного материала ПВ является интенсивное пенообразование, сопровождающее этот процесс. Кислород, образующийся в каждой точке реакционного пространства, где имеется ОВ и ПВ, поднимается к поверхности жидкости в виде мелких газовых пузырьков, которые сливаются в устойчивую пену. Кислорода, а следовательно, и пены образуется очень много: 1 мл 30% раствора ПВ дает при 0°С 110,96 мл газообразного кислорода, что составляет в пересчете для 50°С—131,34 мл, 100°С —150,7 мл. Чем энергичнее протекает реакция, а она усиливается при повышении температуры и концентрации ПВ, тем быстрее нарастает объем пены, которая мгновенно поднимается вверх и выходит за пределы реакционной емкости. Вместе с пеной утрачиваются и мелкие кусочки трупного материала. Выбросы пены из колбы хорошо известны всем, кому приходится использовать методы, в которых разрушение начинается с применения ПВ. Такие методики рекомендованы для обнаружения планктона. В настоящее время вспенивание упреждается постепенным добавлением ПВ каплями при комнатной или более низкой температуре. Предлагается при сильном вспенивании прекратить нагревание и добавить 1—3 капли изоамилового спирта в качестве пеногасителя. Эти манипуляции снижают эффективность реакции, а значит, и увеличивают продолжительность разрушения.
Мы задались целью найти эффективный антивспениватель или пеногаситель (ПГ), который позволил бы результативно использовать высокий окислительный потенциал ПВ. При этом мы исходили из следующих соображений:
1.Устойчивость пены определяется поверхностным натяжением жидкости, пленки которой образуют стенки газовых пузырьков. Чем меньше поверхностное натяжение, тем легче лопаются пузырьки газа и, следовательно, неустойчивей пена. 1аким образом, искомый ПГ должен обладать низким поверхностным натяжением и высокой поверхностной активностью.
2. Пенообразование происходит на поверхности жидкости. Поэтому ПГ должен располагаться в ее верхнем слое. Для этого ПГ должен практически не растворяться в воде и водных растворах ПВ и быть легче их, т. е. иметь плотность менее 1,0 г/см3.
3. Чтобы ПГ не расходовался на реакции с ОВ и ПВ, испарение и унос с выделяющимися кислородом и парами, он должен быть химически инертным, иметь достаточно высокую температуру кипения и низкую летучесть (фугитивность).
После литературного поиска и опытов мы пришли к выводу, что среди доступных реагентов подходящим для наших целей является амиловый спирт (АС): поверхностное натяжение на границе с воздухом —26,03 мн/н (эрг/см2) при 15°С, растворимость 2,19% при 20°С, плотность—0,814 г/см3 при 20°С, температура кипения — 138,06°С. Высокая пеногасительная способность АС позволила разработать оригинальный метод разрушения биоматериала с помощью ПВ, заключающийся в следующем.
В термостойкую колбу поместить трупный материал, прилить пергидроль и АС. Нагреть и кипятить, добавляя при необходимости АС и пергидроль. Температура кипения сначала соответствует тем пературе кипения пергидроля (105 110°С). Кусочки биоматериала пронизываются пузырьками образующегося внутри них кислорода и увеличиваются в размерах («раздуваются»), благодаря химическому разрушению пигментных веществ светлеют и приобретают бледно-желтую окраску. Подъемная сила газа столь велика, что кусочки не только всплывают к поверхности жидкости, но и поднимаются над ней, «подпираемые» самыми нижними из них. Постепенно кусочки как бы «разлохмачиваются», уменьшаются в размерах и распространяются по всей жидкости. В связи с нарастанием вязкости раствора температура кипения может незначительно повыситься. Реакция среды на протяжении всего разрушения близка к нейтральной. Кипячение можно продолжать как до стадии деструкции, так и почти полной минерализации объекта. В первом случае содержимое колбы представляет собой однородную мутную светло-желтую эмульсию солей жирных кислот (мыла), которая при охлаждении расслаивается на желтую прозрачную жидкость внизу и более вязкий верхний слой. При встряхивании или нагревании содержимое колбы принимает прежний вид. Деструкция 100—, 200 г биоматериала занимает около 1 часа. Во втором случае содержимое колбы становится бесцветным или слегка желтоватым, прозрачным, на поверхности отмешиваются белые рыхлые хлопья, не окисляемые ПВ. Добиться полной минерализации биоматериала только пергидролем не удается.
Основные условия разрушения сводятся к следующим параметрам.
Можно использовать колбу Кьельдаля или другую круглую колбу с длинной горловиной, играющей роль обратного холодильника, что позволяет возвращать в колбу часть испаряющегося АС. Расширение круглой колбы от дна в стороны позволяет (в сочетании с применением АС) удерживать высоту пены на определенном уровне. Удобны плоскодонные колбы, не требующие фиксации их в лабораторном штативе. Для объекта весом 100—200 г достаточно колбы объемом 1 л.
Трупные мягкие ткани и органы предварительно измельчают. Кровь, промывные воды и другие жидкости можно упарить, в противном случае концентрация ПВ снижается, а вместе с ней и скорость окисления. Кости, хрящи и сухожилия нашим методом разрушать нецелесообразно.
Используем пергидроль любой имеющейся концентрации. Государственной фармакопеей СССР установлена концентрация ПВ в пергидроле 27,5-31%, но через аптечную сеть могут поступить партии, содержащие до 38% ПВ. Концентрация первой порции ПВ снижается сначала за счет разбавления водой, содержащейся в объекте, а затем как за счет разложения ПВ, так и разбавления новообразующейся при этом водой. С понижением концентрации ПВ уменьшается и интенсивность окисления ОВ, о чем можно судить по такому демонстративному признаку, как кислородообразование, характеризующееся возникновением мелких пузырьков газа во всем объеме жидкости. Поэтому его легче отличить от кипения, при котором пузырьки воздуха зарождаются на дне колбы только в нескольких местах и отрываются от дна периодически крупными пузырями, как бы толчкообразно. Поддерживать концентрацию ПВ, а следовательно, и скорость окисления на достаточном уровне можно добавлением пергидроля. Количество ПВ, достаточное для окисления ОВ, определяется в конечном итоге количеством химических связей, которые необходимо разрушить. Для объекта весом 100—200 г требуется примерно 200—250 мл пергидроля.
Для того чтобы ПГ выполнял свою роль, он должен располагаться на поверхности жидкости слоем толщиной не менее чем в одну молекулу. Для выполнения этого условия достаточно вначале прибавить несколько капель АС. Но при кипячении молекулы АС переходят в газовую фазу и уносятся с кислородом. Поэтому для поддержания мономолекулярного слоя следует добавлять АС в колбу, ориентируясь на высоту пены. Практически важно удерживать пену на уровне наиболее широкой части колбы, не позволяя ей достигать внутреннего отверстия горловины, в которой подъем пенного столба происходит особенно быстро. Удобнее вносить АС из капельницы, укрепленной над колбой. Через некоторое время от начала кипячения пенообразование усиливается за счет перехода в раствор отщепляемых пептидов и аминокислот, образования гуминовой кислоты и солей высших жирных кислот, улучшающих стабильность пены.
Таким образом, происходящие при разрушении основные химические и физические процессы относительно просты, что позволяет легко объяснить сопровождающие их явления.
Достоинства нашего метода состоят в следующем.
1.Используется в основном один и такой широко распространенный в медицине реактив, как пергидроль.
2. Происходит 0ыстрое разрушение по сравнению с общепринятыми кислотными методами, требующими 6 часов и более.
3. Отсутствует опасность необратимого и трудноустранимого обугливания ОВ, характерного для кислотных методов.
4. Раствор легко упаривается до желаемого объема, в том числе и объема центрифужной пробирки.
5. ПВ малотоксичен (ПДК в СССР для него не установлена), а образующиеся вода и кислород нетоксичны. Это выгодно отличает наш метод от кислотных, так как серная и азотная кислоты, продукты их распада (сероводород, окислы азота и др.) относятся по степени воздействия на организм ко второму (высокоопасные вещества) и третьему (умеренно опасные) классам. АС, используемый в нашем методе в незначительных количествах, относится к третьему классу опасности.
Наш метод может быть применен для следующих целей.
1. Определение микроэлементов и «металлических» ядов. Нами специально этот вопрос не изучался. Известно, что при разрушении с помощью ПВ в кислой среде возможны потери галогенов, частично серы, в больших количествах германия, мышьяка, ртути и селена. Не наблюдается потерь висмута, кадмия, хрома, индия, марганца, сурьмы, олова, теллура, ванадия, циркония, бора и многих других элементов. Мешающий проведению качественных реакций избыток ПВ может быть устранен кипячением, добавлением насыщенного водного раствора сульфита натрия или сульфата гидразина тетраоксидом осьмия, гидрооксидом никеля. Летучие элементы можно собирать поглощением паров и кислорода в какой-либо жидкости, например, щелочном растворе пирогаллола.
2. Обнаружение инородных микрочастиц в диагностике утопления (диатомеи, пыльца, споры, минералы), раневых загрязнений (осколки стекла, кирпича, шлак, волокна и т. д.). Некоторые виды диатомеи, минералов, волокон и других микрочастиц разрушаются от действия кислот. Наш метод в отличие от кислотных способов разрушения позволяет расширить спектр выявляемых микрочастиц.
3. Модификация методов разрушения, в которых ПВ используют как первоначальный реагент. Применение АС и кипячение позволяют ускорить пергидрольную стадию и добиться при этом более глубокого разрушения. Если разрушение пергидролем производится при комнатной температуре, то в качестве ПГ можно применить и другие спирты, имеющие более низкую температуру кипения — изоамиловый, бутиловый, изобутиловый.