РАЗРУШЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПЕРГИДРОЛЕМ


А. К. Семячков
 
Тюмень
 
 
Пероксид (перекись) водорода Н202 (ПВ) является сильней­шим реагентом, способным окислить практически все вещества за исключением немногих более сильных, чем он, окислителей, напри­мер, озона, фтора. Исследователи, тем не менее, предпочитают разрушать органические вещества (ОВ) другими реактивами — концентрированными кислотами, щелочами и др. А если и исполь­зуют ПВ, то в смеси с этими реактивами или после предваритель­ной обработки ими ОВ. Окисление одним ПВ применяют редко. В. Ф. Крамаренко (1989) указывает вслед за Р. Боком (1984), что при взаимодействии ПВ с некоторыми ОВ может произойти взрыв. Поэтому сначала необходимо частично окислить ОВ концентри­рованной серной кислотой или смесью концентрированных серной и азотной кислот, а затем добавлять ПВ.
Мы полагаем, что значение взрывчатых свойств ПВ и его соеди­нений в данном случае преувеличено. Параметры, при которых эти свойства могут проявиться, настолько хорошо известны, что в спра­вочниках по технике безопасности не упоминается о взрывоопасности ПВ.
В растворах взрыв может быть инициирован сильным ударом или открытым пламенем при концентрации ПВ более 80% и нали­чии некоторых органических веществ или катализаторов.
По нашим наблюдениям, некоторые процессы, происходящие в растворе ПВ при разрушении трупного материала, могут про­извести впечатление микровзрывов. Дело в том, что ПВ действует не только на поверхности кусочков биоматериала, но проникает и внутрь. Окисляя ОВ, ПВ разлагается на кислород и воду. Обра­зующийся кислород, накапливаясь внутри кусочков, разрывает их с легким треском. При этом кусочки перемещаются в какую-либо сторону или разрываются на части. В парах взрыв может произойти, если они содержат 26 и более молярных % ПВ и контактируют с катализатором, нагретым некаталитическим материалом (напри­мер, алюминий при 150°С и выше) или искрой. Пары с такой кон­центрацией ПВ могут возникнуть только при кипячении 70% и бо­лее концентрированных растворов ПВ. Таким образом, главным условием для возникновения взрыва является высокая концентра­ция ПВ, которой нельзя достигнуть при кипячении пергидроля в открытой колбе со свободным выделением паров. Для концентри­рования растворов ПВ и его паров необходимы специальные условия и оснащение. Наш личный опыт разрушения органов и тканей пергидролем, проводимого с обычными предосторожностями, убеж­дает в безопасности работы с ним.
По нашему мнению, серьезным препятствием для окисления трупного материала ПВ является интенсивное пенообразование, сопровождающее этот процесс. Кислород, образующийся в каждой точке реакционного пространства, где имеется ОВ и ПВ, поднимает­ся к поверхности жидкости в виде мелких газовых пузырьков, кото­рые сливаются в устойчивую пену. Кислорода, а следовательно, и пены образуется очень много: 1 мл 30% раствора ПВ дает при 0°С 110,96 мл газообразного кислорода, что составляет в пересче­те для 50°С—131,34 мл, 100°С —150,7 мл. Чем энергичнее проте­кает реакция, а она усиливается при повышении температуры и концентрации ПВ, тем быстрее нарастает объем пены, которая мгновенно поднимается вверх и выходит за пределы реакционной емкости. Вместе с пеной утрачиваются и мелкие кусочки трупного материала. Выбросы пены из колбы хорошо известны всем, кому приходится использовать методы, в которых разрушение начинает­ся с применения ПВ. Такие методики рекомендованы для обнаруже­ния планктона. В настоящее время вспенивание упреждается посте­пенным добавлением ПВ каплями при комнатной или более низ­кой температуре. Предлагается при сильном вспенивании прекра­тить нагревание и добавить 1—3 капли изоамилового спирта в ка­честве пеногасителя. Эти манипуляции снижают эффективность реакции, а значит, и увеличивают продолжительность разрушения.
Мы задались целью найти эффективный антивспениватель или пеногаситель (ПГ), который позволил бы результативно использо­вать высокий окислительный потенциал ПВ. При этом мы исходили из следующих соображений:
1.Устойчивость пены определяется поверхностным натяжением жидкости, пленки которой образуют стенки газовых пузырьков. Чем меньше поверхностное натяжение, тем легче лопаются пузырь­ки газа и, следовательно, неустойчивей пена. 1аким образом, иско­мый ПГ должен обладать низким поверхностным натяжением и высокой поверхностной активностью.
2.        Пенообразование происходит на поверхности жидкости. Поэтому ПГ должен располагаться в ее верхнем слое. Для этого ПГ должен практически не растворяться в воде и водных раство­рах ПВ и быть легче их, т. е. иметь плотность менее 1,0 г/см3.
3.        Чтобы ПГ не расходовался на реакции с ОВ и ПВ, испаре­ние и унос с выделяющимися кислородом и парами, он должен быть химически инертным, иметь достаточно высокую температуру кипе­ния и низкую летучесть (фугитивность).
После литературного поиска и опытов мы пришли к выводу, что среди доступных реагентов подходящим для наших целей яв­ляется амиловый спирт (АС): поверхностное натяжение на грани­це с воздухом —26,03 мн/н (эрг/см2) при 15°С, растворимость 2,19% при 20°С, плотность—0,814 г/см3 при 20°С, температура кипения — 138,06°С. Высокая пеногасительная способность АС позволила разработать оригинальный метод разрушения биоматериа­ла с помощью ПВ, заключающийся в следующем.
В термостойкую колбу   поместить трупный   материал,   прилить пергидроль и АС. Нагреть и кипятить, добавляя при необходимости АС и пергидроль. Температура кипения сначала соответствует тем пературе кипения пергидроля   (105    110°С). Кусочки биоматериа­ла пронизываются пузырьками образующегося внутри них кисло­рода   и   увеличиваются   в   размерах   («раздуваются»),   благодаря химическому разрушению пигментных веществ светлеют и приобре­тают бледно-желтую окраску. Подъемная сила газа столь велика, что кусочки не только всплывают к поверхности жидкости, но и поднимаются над ней,   «подпираемые» самыми   нижними   из   них. Постепенно кусочки как бы «разлохмачиваются», уменьшаются в размерах и распространяются по всей жидкости. В связи с нараста­нием вязкости раствора температура кипения может незначительно повыситься. Реакция среды на протяжении всего разрушения близ­ка   к нейтральной.   Кипячение   можно продолжать как до стадии деструкции, так и почти полной минерализации объекта. В первом случае содержимое колбы представляет собой однородную мутную светло-желтую эмульсию солей   жирных   кислот   (мыла),   которая при охлаждении расслаивается на желтую прозрачную жидкость внизу и более вязкий верхний слой. При встряхивании или нагрева­нии содержимое колбы принимает прежний вид. Деструкция 100—, 200 г биоматериала занимает около 1 часа. Во втором случае содер­жимое   колбы   становится   бесцветным   или   слегка   желтоватым, прозрачным, на поверхности отмешиваются белые рыхлые хлопья, не окисляемые ПВ. Добиться полной минерализации биоматериа­ла только пергидролем не удается.
Основные условия разрушения сводятся к следующим парамет­рам.
Можно использовать колбу Кьельдаля или другую круглую кол­бу с длинной горловиной, играющей роль обратного холодильника, что позволяет возвращать в колбу часть испаряющегося АС. Рас­ширение круглой колбы от дна в стороны позволяет (в сочетании с применением АС) удерживать высоту пены на определенном уров­не. Удобны плоскодонные колбы, не требующие фиксации их в лабо­раторном штативе. Для объекта весом 100—200 г достаточно кол­бы объемом 1 л.
Трупные мягкие ткани и органы предварительно измельчают. Кровь, промывные воды и другие жидкости можно упарить, в про­тивном случае концентрация ПВ снижается, а вместе с ней и ско­рость окисления. Кости, хрящи и сухожилия нашим методом разру­шать нецелесообразно.
Используем пергидроль любой имеющейся концентрации. Госу­дарственной фармакопеей СССР установлена концентрация ПВ в пергидроле 27,5-31%, но через аптечную сеть могут поступить партии, содержащие до 38% ПВ. Концентрация первой порции ПВ снижается сначала за счет разбавления водой, содержащейся в объекте, а затем как за счет разложения ПВ, так и разбавления новообразующейся при этом водой. С понижением   концентрации ПВ уменьшается и интенсивность окисления ОВ, о чем можно судить по такому демонстративному признаку, как кислородообразование, характеризующееся возникновением мелких пузырьков газа во всем объеме жидкости. Поэтому его легче отличить от кипения, при котором пузырьки воздуха зарождаются на дне колбы только в нескольких местах и отрываются от дна периодически крупными пузырями, как бы толчкообразно. Поддерживать концентрацию ПВ, а следовательно, и скорость окисления на достаточном уровне можно добавлением пергидроля. Количество ПВ, достаточное для окисления ОВ, определяется в конечном итоге количеством хими­ческих связей, которые необходимо разрушить. Для объекта весом 100—200 г требуется примерно 200—250 мл пергидроля.
Для того чтобы ПГ выполнял свою роль, он должен распола­гаться на поверхности жидкости слоем толщиной не менее чем в одну молекулу. Для выполнения этого условия достаточно вначале прибавить несколько капель АС. Но при кипячении молекулы АС переходят в газовую фазу и уносятся с кислородом. Поэтому для поддержания мономолекулярного слоя следует добавлять АС в колбу, ориентируясь на высоту пены. Практически важно удер­живать пену на уровне наиболее широкой части колбы, не позволяя ей достигать внутреннего отверстия горловины, в которой подъем пенного столба происходит особенно быстро. Удобнее вносить АС из капельницы, укрепленной над колбой. Через некоторое время от начала кипячения пенообразование усиливается за счет перехода в раствор отщепляемых пептидов и аминокислот, образования гуминовой кислоты и солей высших жирных кислот, улучшающих стабильность пены.
Таким образом, происходящие при разрушении основные хими­ческие и физические процессы относительно просты, что позволяет легко объяснить сопровождающие их явления.
Достоинства нашего метода состоят в следующем.
1.Используется в основном один и такой широко распростра­ненный в медицине реактив, как пергидроль.
2.        Происходит 0ыстрое разрушение по сравнению с общепри­нятыми кислотными методами, требующими 6 часов и более.
3.        Отсутствует опасность необратимого и трудноустранимого обугливания ОВ, характерного для кислотных методов.
4.        Раствор легко упаривается до желаемого объема, в том числе и объема центрифужной пробирки.
5.        ПВ малотоксичен (ПДК в СССР для него не установлена), а образующиеся вода и кислород нетоксичны. Это выгодно отли­чает наш метод от кислотных, так как серная и азотная кислоты, продукты их распада (сероводород, окислы азота и др.) относятся по степени воздействия на организм ко второму (высокоопасные вещества) и третьему (умеренно опасные) классам. АС, исполь­зуемый в нашем методе в незначительных количествах, относится к третьему классу опасности.
Наш метод может быть применен для следующих целей.
1. Определение микроэлементов и «металлических» ядов. Нами специально этот вопрос не изучался. Известно, что при разрушении с помощью ПВ в кислой среде возможны потери галогенов, частич­но серы, в больших количествах германия, мышьяка, ртути и селе­на. Не наблюдается потерь висмута, кадмия, хрома, индия, марган­ца, сурьмы, олова, теллура, ванадия, циркония, бора и многих дру­гих элементов. Мешающий проведению качественных реакций избы­ток ПВ может быть устранен кипячением, добавлением насыщен­ного водного раствора сульфита натрия или сульфата гидразина тетраоксидом осьмия, гидрооксидом никеля. Летучие элементы можно собирать поглощением паров и кислорода в какой-либо жидкости, например, щелочном растворе пирогаллола.
2.        Обнаружение инородных микрочастиц в диагностике утоп­ления (диатомеи, пыльца, споры, минералы), раневых загрязне­ний (осколки стекла, кирпича, шлак, волокна и т. д.). Некоторые виды диатомеи, минералов, волокон и других микрочастиц разру­шаются от действия кислот. Наш метод в отличие от кислотных способов разрушения позволяет расширить спектр выявляемых микрочастиц.
3.        Модификация методов разрушения, в которых ПВ исполь­зуют как первоначальный реагент. Применение АС и кипячение позволяют ускорить пергидрольную стадию и добиться при этом более глубокого разрушения. Если разрушение пергидролем про­изводится при комнатной температуре, то в качестве ПГ можно применить и другие спирты, имеющие более низкую температуру кипения — изоамиловый, бутиловый, изобутиловый.